移植浩世界

嵌合体和移植耐受

刘光伟 译（中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室移植生物学研究组, 北京 100080）


[摘 要] 实验模型研究 (1953-1956) 证明在免疫不成熟或照射动物的获得性供者特异性同种移植耐受明显同供者白细胞嵌合体有关。进一步人们理论外推认为，在免疫缺陷的人作为受者的骨髓移植成功也可能与此有关。但是，此后在临床（1959年）及实验器官移植一系列成功实践中，发现明显缺乏白细胞嵌合体存在。因此，多年来器官和骨髓移植成功可能涉及完全不同的机制。在1992年发现少量供者白细胞在长期存活的受者器官存在，即微嵌合体。因此，我们推测器官移植是白细胞嵌合体依赖性部分耐受，并且同种移植可能存在供者与受者双向免疫效应，在受者体内共存可以导致相互克隆耗竭和外周克隆剔除。因此，有研究者认为，个体同种异基因反应可能是MHC限制性T细胞互相识别及细胞内寄生虫与宿主相互反应的结果，而且这种免疫反应或不反应的机制可能是供受者各自抗原迁徙相互作用导致。克隆耗竭－剔除和免疫忽视等免疫不反应机制及其调节机理的阐明解决了许多历史上的移植谜团，并将其应用于改进当前人类移植受体免疫抑制时机和剂量选择等方面。

虽然器官移植成功地解决了器官特异性疾病治疗，但其机制一直是一个科学上的谜团。这主要是由于40余年来人们一直误认为供者白细胞嵌合体明显同获得性供者特异性耐受相关，而后来又发现其不是器官移植的必要因素。

白细胞嵌合体同耐受相关联

现代移植研究通常可以追朔到1943年，Medawar和Gibson等证明组织排斥是一种免疫排斥反应。十年后，Billingham等研究表明，这种适应性免疫防御反应具有脆弱性。首先，移植脾脏白细胞或骨髓细胞给妊娠或新出生的受体小鼠，这些小鼠常免疫不成熟，很难去排斥供者细胞。其次，受者如已有供者白细胞嵌合体，可以容易接受供者小鼠皮肤，而对无关第三者排斥。这种对供者组织的获得性耐受明显同白细胞嵌合体相关。 1955年，在成年小鼠骨髓移植前预先给予超致死剂量整体照射去减弱其免疫反应，可以产生相似的诱导耐受效果。进一步研究认为，这种移植耐受同白细胞嵌合体明显相关。然后，研究者在照射的受者探讨移植供者造血细胞或进行器官移植的可能性。现在认为这是完全可行的。另外，骨髓移植明显也是治疗造血系统疾病的一种有效手段。临床骨髓移植证明，除非供者和受者有很好的组织兼容性，否则移植后完全免疫活性的供者白细胞一定会引起移植物抗宿主病。因为仅有少数人HLA抗原是完全一致的，所以临床骨髓移植治疗一直被延误。直到1968年，可以找到HLA相配骨髓受者，病人终于可以获得同小鼠相似的移植免疫耐受治疗效果。

器官和骨髓移植的不同

目前，许多人肾移植同肝和心脏移植一样已获成功。这些器官受体均没有白细胞嵌合体。因此，器官受体不发生GVHD并发症并不奇怪。大多数受者都有HLA错配的移植物，因为没有病人给予供者淋巴细胞输入，所以移植器官受体内可能没有白细胞嵌合体存在。在没有白细胞嵌合体时，器官移植移入成功率同小鼠模型耐受相关或同人骨髓移植耐受情况有关，否则马上被排斥。同这种观点一致，人器官移植不象骨髓移植可能终生需要免疫抑制剂。

免疫抑制剂非依赖性器官受体

照射后 在1959年波士顿和巴黎等进行的给予病人亚致死剂量照射并白细胞嵌合体输入，这是划时代的手术范例。同卵双生兄弟双胞胎（非HLA相配）捐赠的肾移植物，在受者体内肾功能保持正常20年和26年无免疫抑制处理。该结果是惊人的。至今，还没有一例无任何处理肾移植成功超过73天的或单纯照射处理移植成功超过30天的病例。

药理学免疫抑制后 在动物 因为照射的危险性大，所以在证明抗白血病药6-巯基嘌呤及其咪唑衍生物硫唑嘌呤可以抑制免疫后，整体照射即被取代。每日给予嘌呤类似物可以适当延迟家兔皮肤同种异体移植物存活。肾同种异体移植给远系杂交种狗也明显可以被免疫抑制剂保护，但仅约5%动物可存活至100天。重要的是，当停药后大约5%左右动物排斥同种异体移植物。在肝移植受者给予硫唑嘌呤3～4月处理或少量给予术间剂量抗淋巴细胞球蛋白，停药后可以有更高存活率。到1965年，在给予有限量免疫抑制剂后，肝永久移植比肾脏更容易，同种异体移植手术更容易获得成功，后来大量近亲交配啮齿类动物实验证明了这一结论。在病人 同时，研究者认识到一系列肾受者在给予硫唑嘌呤处理可以逆转其排斥反应，更重要的是常通过改变供者特异性反应状态，即诱导免疫耐受而获成功。在移植后每天给予病人硫唑嘌呤直到一周，并保持给强的松抗排斥反应。虽排斥反应差不多在每一病例都出现，但随机HLA配对的亲代、同胞甚至更远的家族供者同种移植成功1年存活率高达75%。在1963年开始报告时，存活病人仍在接受免疫抑制治疗，但随免疫耐受形成，我们可以推测逐渐可以减少免疫抑制剂的应用。事实上，46位家族供者肾移植病人中9位在1962年开始经过14个月的治疗后，肾功能维持可达40年。更重要的是，9个中7人最后停用免疫抑制剂而没有发生排斥反应。而且，目前9个受者中8人仍然存活并携带有最长同种移植的肾脏。虽早期治疗结果令人鼓舞，但在1963年两种处理措施被正式改变。其一是由于免疫抑制相关感染延迟或阻碍手术治疗，所以移植手术前常给予的硫唑嘌呤被减量。其二是大剂量强的松可常规在手术治疗给予而不是在发生排斥反应时给药。而且，当肾供者是遗传不相关时，其移植物急性损失率达35％。大剂量预防性免疫抑制剂减少了早期移植物损失，但再没有不给药受者肾移植成功的报道。直到40年后，同种移植物移植成功机制阐述后，人们才认识到免疫抑制剂给药剂量和时机选择的重要性。特别是类固醇类免疫抑制剂被应用，肝脏移植才获得同肾移植相似的效果。

没有免疫抑制的移植

1966年，法国及其后英国和其他国家均相继证实肝移植不给予治疗大约20％远系移植给猪可获成功。重要的是，这些猪是接受皮肤和肾移植共同供者。接着，新生肝移植在少数啮齿类动物获成功，心脏和肾同种移植物也获成功，甚至在移植给小鼠实验中也可以获得成功。

组织配型与免疫抑制

在啮齿类移植模型中供受者组织相容性是获得器官移植成功的重要因素。因此，HLA配型可能是器官移植发展重要手段。当除HLA兼容性极好时外，配型不能给予更多优势时，临床几乎完全依赖于更有潜力的新药物。1964年至今，一直采用单药或联合用药进行防治排斥反应。新药出现，马上进行动物实验研究并评价，而临床上随着硫唑嘌呤和强的松治疗方案的修改，一直采用联合用药。器官移植成功直接依赖于更好的免疫抑制剂。抗淋巴细胞抗体制剂如环孢霉素A、他克莫西司出现为器官移植带来新希望。这些新药物应用在非肾器官移植中病人和移植物存活方面更具有决定性作用。在1980年，环孢霉素A作为基础用药和他克莫西司出现明显成倍地增长了肝移植1年和更长的存活率。

嵌合体问题

自从1990年，供者白细胞嵌合体器官移植中被涉及后，近年基础或临床一直在研究其应用可能性。在表面上，嵌合体缺失状态给予或不给予免疫抑制剂。而实验器官移植模型有些不同于耐受。这方面的专业术语包括移植耐受、假耐受性和操纵耐受性。理论上认为嵌合体对解释同种器官移植机制没有帮助。这涉及抑制否决或调节性T细胞。自我永存细胞因子个体遗传型抗体，耐受原抗原可溶HLA抗原移植物分泌、抗原提呈偏离等。大多数假说现仍有捍卫者。

器官嵌合体

早期移植同种移植器官迅速变成供受者混合状态（即器官嵌合体）。这首先被Karyotyping等1968年肝移植手术中用男性尸体供者给女性受者研究证明。骨髓来源过客白细胞包括枯否氏细胞在100天内主要被受者女性来源细胞取代，而同种移植物其他部分仍为男性。一直以为这是肝移植中独特的特征，直到1991年大多数移植大鼠和人小肠淋巴组织被受者同一谱系细胞取代。这时，类似发现在移植人肾脏和胸器官同种移植中也被证实，明显所有被移植器官均是嵌合状态。

受者嵌合体 间接证据 什么使供者的白细胞被受者细胞取代呢？一直有一个长期被忽略的线索。在1962～1963年，结核菌素皮肤实验和一系列皮内抗原实验首先在美国科罗拉多州大学肾受者和其他自愿供者进行。皮肤阴性实验的受者在给予皮肤和供者肾移植后，皮试阳性率达77％，研究者认为这是过继传递供者粒细胞免疫的结果。由于既没有大量过客白细胞也没有这些细胞迁徙证据，所以那时这种解释很难服人。进一步过继免疫证据在1969年人体肝肾受者获得新的供者特异性免疫球蛋白后被证明。在1984年，ABO血型完全相配的肝供者血凝集素可引起凝血，这时及其后十余年成功研究显示，所有器官移植后白细胞迁徙可能是一种惊人的现象，然而移植后30～60天循环的供者细胞迅速减少和流式细胞仪不可检测。因此，大多数观察者确信供者细胞进行了免疫清除。直接证据 1992年春，在成功移植3～29年的肾或肝受者血和组织开始找寻供者白细胞。采用敏感的细胞染色机和PCR技术，少量供者白细胞（微嵌合体）在30个病人中的一个或多个外周受者部位被检测到。X或Y染色体（当供者或受者是异性）或供者特异性HLA抗原被用作标志物。通常供者白细胞在肝受者比肾受者存在数量更多。长期存在多种起源的微嵌合体暗示，造血淋巴细胞前体和干细胞是器官移植的过客白细胞。

统一的移植观点

历史上，移植一直被认为属于单纯免疫细胞调节的范畴。在器官受者，排斥反应减弱主要是由于供者白细胞被排除，相反骨髓移植受者造血干细胞被取代也是相似的机制。这一学说证据在1989年被观察到，基本所有的骨髓受者实际上都有少量残存的自体造血淋巴细胞。随着长期存活，器官受者逐渐发现更多的供者细胞存在。很明显，器官移植和骨髓移植成功就是白细胞嵌合体最好的证据。 我们假定同种移植的最初机制包括供者和受者细胞反应，引起相互克隆耗竭并随之周围克隆剔除。器官移植显性反应，克隆耗竭和剔除可以解释排斥逆转和可调控耐受形成。这在30年前肾脏受体中已被认识到。骨髓受者照射只是转移免疫优势给移植物，相互耐受可以解释为什么在器官移植后GVHD很惊人，甚至在淋巴丰富同种移植物例如小肠和肝也表现为同样的反应。另外，影响细胞嵌合体和移植耐受强烈相关的原因也是很明显的。白细胞是移植抗原可以迁徙到受者淋巴器官诱导克隆激活、移植克隆耗竭和剔除效应的仅有来源。最终，在大多数器官移植环境中，通过免疫机制可以防止诱导供者细胞毁坏。 

免疫调节

基础免疫更统一观点主要是Rolf等早期研究两篇综述指出了MHC限制性T细胞识别和对非病理性微环境即细胞内寄生虫的反应。Rolf等近来研究集中于少量残存病原性在维持免疫中作用或替代耐受和对这些感染因子的反应。关于免疫调节可能有两种机制可以解释同种异体移植物的免疫调节反应。一种是在受者淋巴器官，抗原即供者白细胞诱导的克隆耗竭－剔除。第二种机制是免疫忽略。如果抗原没到达淋巴目的地，它的存在就不可被识别。成功的移植主要是涉及这样两种机制。供者白细胞从一个器官移植物迁徙进受者是沿着同非细胞病理病原体相似的造血途径，选择性地首先到受者淋巴器官。几天或几周后供者细胞逃脱免疫反应毁坏将到非淋巴位点。这些位点对细胞或体液免疫是不可达到的位点。在这些优势非淋巴位点，过客白细胞可以被忽略或忘记。这相似于机体感染后残存的微生物，供者白细胞可以迁徙到淋巴器官，维持克隆耗竭和剔除，结果诱导可调控免疫相似于肝炎感染后出现的不同愈后结果。 移植存在更多历史之谜。例如，猪和啮齿类器官移植可以诱导天然耐受。因为抗移植物反应太弱，而不能排除供者细胞。肝是最能诱导免疫耐受的器官，因为它有大量过客白细胞。另外，也能理解为什么天然耐受在这样的模型通过给予免疫抑制剂可以被解除。 

致耐受性免疫抑制

Zinkernagel等第二篇综述谈到如何改进未来移植受体的治疗。我们描述在大多数移植中，移植开始多药联合给予就破坏了克隆耗竭剔除基本耐受机制。我们第一个建议就是在移植后尽量减少给予免疫抑制剂，避免自我破坏效应。最小理想化免疫抑制理论在许多同系啮齿器官移植中已经被证明。用来抗供者反应仅在术后短期阶段进行，然而在这些实验模型中高度标准化治疗模式不能被应用于远系人类。它们可能具有不可预计的免疫屏障。在移植前治疗可能更容易比移植后确定免疫抑制的正确剂量。移植前处理减少整体受者反应更容易耗竭供者特异性免疫反应。通过减少免疫抑制实际上优势在于受者更安全开始它们的移植后过程，抑制逐渐减少或增加免疫力。回顾Murray及其合作者和Hambruga等在1959年1月和6月通过仅预处理在受照射异卵双胞胎肾受者获得持久耐受。不久就领会到仅预处理是不够的。预处理同移植后免疫抑制结合最终可去除药物治疗。在1962～1963年Denver等肾受者获成功。接着预防性免疫抑制被广泛应用。虽然受者预处理和最小剂量移植后免疫抑制耐受理论在二十世纪六、七十年代已被理解，但它们不能被有效地应用。 在2001年，随着新一代药物出现，预处理采用单一剂量有效抗淋巴药物制剂，人化单抗、阿仑单抗等。通常是他克莫司，仅在突破排斥反应时加其他因子。当排斥反应出现时，在尸肾移植受者短期应用免疫抑制剂药物，即用2个剂量单抗的强的松早期排斥反应可被逆转。即在5～6个月间隔剂量，隔日给他克莫司停药逐渐拉长给药间隔。病人自从2002年7月给他克莫司一直每周稳定在一个剂量。这已成为目前标准性治疗方案，已被用于600例以上肾、肝、小肠、胰腺获肺移植受者，3/4以上病人接受他克莫司间隔剂量或者根本没有应用免疫抑制剂等治疗。据此结果，在其它器官移植受者病人同样获得生存质量比我们以前系统治疗更好的治疗效果。同样治疗理论希望应用于异种移植，半乳糖转移酶基因负责低等哺乳动物高抗原α-Gal表位的合成。该基因在无性繁殖猪已被敲除。这些猪明显依赖更多的遗传修饰，但我认为如果必要的变化被完成，那白细胞嵌合体依赖性异种移植机制将同同种移植免疫机制相类似。

其它意义

如果这里提出的范例被普及，可能在不同医疗领域有大量潜在治疗意义。象自体免疫病。Ehrlich推测可能有一种机制可以预防它："……一个调节理论还没有被描述"他想象的计划我认为可能包括，可实行的移植不反应机制，即如何在自体免疫性疾病中诱导移植免疫耐受，从而最终达到治疗效果。

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PNAS October 5, 2004 vol. 101 suppl. 2 14607–14614