移植浩世界

乙型肝炎病毒对核苷类抗病毒药物的耐药性
研究进展
张继明
【中图分类号】　R512. 6 + 2　【文献标识码】　C　【文章编号】　1671 - 0800 (2005) 07 - 0387 - 04
　　目前被美国FDA批准的治疗慢性
乙型肝炎的药物已增加至5 种,即普
通α干扰素、聚乙二醇( PEG)干扰素
α22a (商品名哌罗欣) 、拉米夫定( lami2
vudine) 、阿德福韦( adefovir) 、恩替卡
韦( entecavir) 。虽然一些新的具有抗
乙型肝炎病毒(HBV)作用的核苷酸类
似物( nucleotide analogue)或核苷类似
物( nucleoside analogue)还处在临床试
验阶段,但其中的一些品种也将很快
被批准用于慢性乙型肝炎的治疗,核
苷类抗HBV 药物的临床应用是慢性
乙型肝炎治疗史上的里程碑。以拉米
夫定为代表的核苷类抗HBV 药物的
作者单位:复旦大学附属华山医院,上
海　200040
作者简介:张继明,男,医学博士,传染
病学副主任医师。
广泛应用在为慢性乙型肝炎患者带来
福音的同时,也带来了严重的耐药问
题。HBV对核苷类抗HBV 药物产生
的耐药性是阻碍其临床应用、降低其
作用的主要原因。本文以拉米夫定为
重点,简要介绍HBV对核苷类抗病毒
药物的耐药性研究进展。
1　HBV产生耐药性的分子病毒学基
础
　　大多数生物能够通过复杂的机制
来维持其遗传信息的稳定性,而病毒
却相反,它们处于快速和持续的基因
变异之中。HBV 具有独特的生活周
期,在复制过程中尽管产生大量的子
病毒,但并不直接杀伤被其感染的肝
细胞。由于HBV 的复制需通过逆转
录机制, HBV Pol是一种逆转录酶,缺
乏校正的功能,因此HBV变异较为常
见,变异率比其他DNA病毒大约要高
10倍左右, 发生变异的频率大约为
(1. 4～3. 2) ×10 - 5核苷酸替换/位点/
年。多数研究结果表明,血清中总的
病毒载量可高达1011病毒颗粒/ml,血
HBV池的半衰期大约为1 ～2d,每日
新产生病毒颗粒的数量可能高达1011
病毒颗粒。如此高的病毒载量和更新
率以及较低的复制忠实性( rep lication
fidelity) 等均可增加变异的产生和
HBV准种池的容量。在一个HBV 感
染者的血清中,在HBV准种池内占多
数的病毒群通常成为优势株。尽管宿
主免疫系统的选择性压力、重叠的读
码框架所引起的限制性、存活能力、病
毒的复制潜能等维持了HBV 优势株
的稳定性,病毒复制的数量和速率对
优势株的稳定性也是十分重要的影响
因素。但相对于其他DNA病毒感染,
在内源性(宿主免疫清除) 和外源性
 (疫苗和抗病毒药物)的选择性压力作
用下,更容易选择出HBV逃避突变株
及耐药株。因此,从理论上讲,对于任
何核苷类HBV药物, HBV均有耐药株
的可能性的,所不同的是出现时间早
晚的差异。
变异病毒的复制必须有可用的复
制空间( rep lication space) 。变异株是
通过占据原来野毒株的位置而获得复
制空间的,此过程的前提是原来野毒
株的消失,而原来野毒株能否消失则
受其本身的复制适应性、肝细胞的更
新、增殖等影响。复制空间可以理解
为肝脏容纳新的HBV ccc DNA分子的
潜力。新生的ccc DNA分子只能在未
感染的细胞、更新的肝细胞、核内
ccc DNA已消失的感染肝细胞中合成。
所以,一株病毒成为优势株首先要增
加其cccDNA合成,然后才能实现病毒
量的扩增。换句话说,只有在拥有新
的复制空间的前提下, HBV耐药株在
肝内的数量才会增加。在所施加的药
物选择性压力撤销后(如停用拉米夫
定) ,原来的野毒株是否重新出现、出
现的时间以及能否成为优势株,同样
取决于是否还存在野生型cccDNA 及
其所占复制空间的大小。
2　HBV耐药的定义
HBV对某种药物的耐药性一般是
指这种药物对HBV 的抑制作用减弱
或无作用,依据判断的方法不同,有三
种类型:
2. 1 　HBV 基因型耐药( genotyp ic re2
sistance) 　是指HBV基因组中的某些
位点发生改变,导致这种药物对HBV
的抑制作用下降或消失。这种HBV
变异与HBV 的耐药性有直接的因果
关系,通过这些变异位点的检测可判
断HBV 有无耐药性。YMDD 基序是
拉米夫定干扰HBV DNA复制的药物
结合点,拉米夫定是通过结合于HBV
多聚酶逆转录活性,使拉米夫定与之
结合力下降或造成HBV YMDD 基序
发生YVDD /YIDD变异,于是HBV 对
拉米夫定产生耐药性。
2. 2　HBV表型耐药(phenotyp ic resist2
ance) 　用体外细胞培养方法,直接测
定某种药物对HBV的抑制作用,即表
型耐药, 通常以抑制病毒复制率
( IC 50)达50%以上所需的药物浓度
来评估其敏感性。IC 50 低于5 倍者
仍被认为敏感, 5～10倍升高者为部分
耐药,大于10倍以上为耐药。由于检
测方法繁琐,费时费力,且代价昂贵,
实验条件要求很高,临床上很难开展。
2. 3　临床耐药( clinical resistance) 　
指临床出现病毒复制不能被抑制,或
HBV 复制一度被抑制后又出现
HBV DNA反跳, 同时并伴有ALT 升
高。如血清HBV DNA 转阴后出现
HBV DNA 反跳, 一般先出现HBV
DNA反跳(在105 copy/ml以上) ,继之
ALT升高。诊断临床耐药时必须排除
拉米夫定治疗中因其他原因引起的
ALT升高, 如依从性差, 服用损肝药
物、酗酒、重叠其他病毒感染、疾病本
身波动或正处于HBeAg血清转换期
等,最好进一步进行基因耐药或表型
耐药检测及分析。
3　核苷类药物的耐药性
　　在已上市或正在进行临床试验的
核苷类药物中,已经报道,拉米夫定、
阿德福韦、恩替卡韦、依曲西他平、LdT
可诱导HBV 耐药株。现以拉米夫定
耐药为重点,介绍拉米夫定耐药率及
其机制、HBV YMDD变异株的复制特
性等研究进展。
3. 1　HBV对拉米夫定的耐药性
3. 1. 1　HBV对拉米夫定耐药率及其
机制
拉米夫定是目前公认的治疗乙型
肝炎的5种药物之一,在短期内可使
HBV DNA 水平下降, 肝功能恢复正
常,肝纤维化程度得到改善。自1999
年拉米夫定在中国上市以来,已有近
百万慢性乙型肝炎患者接受了拉米夫
定治疗,取得了较好的疗效。
拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的主
要缺陷之一是HBV 对其易产生耐药
性。随着治疗时间的延长,耐药率明
显增加。亚洲的临床研究数据显示,
拉米夫定治疗1～4年的基因耐药率
分别为14%、38%、49%和69%。在临
床上, YMDD变异常伴有HBVDNA和
ALT水平的反跳, 40. 6%的病人出现
病情急性加重( Exacerbation) ,有些病
人因并发重症肝炎而死亡。拉米夫定
相关变异株引起病情急性加重的机制
尚不清楚。
目前认为, HBV对核苷类似物耐
药性的产生与HBV P基因变异有关,
并且HBV P基因变异是多位点的,以
C区YMDD 基序的变异最为重要。
HBV对拉米夫定耐药性的产生也是
HBV RT区YMDD基序变异所致。使
用新的命名法,拉米夫定相关的HBV
耐药株的变异位置和类型为rtM204 I/
V (C区) ±rtL180M (B 区) 。最近,还
发现一种新的变异类型,即YSDD 变
异或rtM204S变异(以往报告的基本
是YVDD或YIDD变异) ,这种变异株
是从1例接受拉米夫定治疗18 个月
的患者的血清中发现的,体外转染研
究也证实了这种YSDD变异株对拉米
夫定耐药。
HBV YMDD基序变异引起对拉米
夫定耐药的机制: YMDD 变异可引起
HBV聚合酶空间结构的改变,进而引
起与核苷类似物之间的作用发生改
变,与dNTP或核苷类似物的结合力下
降。根据HBV 野毒株和YMDD 变异
株聚合酶的酶学分析和模拟的HBV
聚合酶晶体结构特点,发现YMDD是
HBV聚合酶的催化位点,当M变为I
或V时可导致氨基酸侧链的柔性减
低,并在HBV聚合酶和拉米夫定三磷
酸盐之间形成空间位阻,与拉米夫定
三磷酸盐的结合力下降。
3. 1. 2 　YMDD 变异株的生物学特性
的研究
以往的研究表明,和野毒株相比,
YMDD变异株的复制能力显著降低。
如有学者报道,在体外, YMDD变异株
对拉米夫定的敏感性比野毒株降低
10000倍。研究结果提示,在体外YM2
DD变异株不能象野生型HBV那样有
效复制,复制能力明显下降。在临床
上也发现,发生YMDD变异者在停用
拉米夫定之后,病人体内的变异株常
常很快被野毒株所取代,提示YMDD
变异株存在复制缺陷。
近年来,随着对YMDD 变异株研
究的进一步深入, 发现并不是所有
YMDD变异株都存在复制缺陷, HBV
YMDD变异株的复制能力并不都是减
弱的。Bock等最近发现, YMDD 变异
伴“a”决定簇内变异时,病人可出现病
情恶化,体外研究结果显示,这种联合
变异可使病毒的复制能力明显增强,
与以往的研究结果不一致。Ono等的
研究结果也提示, HBV聚合酶rtL l80M
(B区)变异可补偿HBV YMDD 变异
株的复制缺陷,使HBV 的复制增强。
其他学者的研究也证实, YMDD 基序
之外的变异可补偿YMDD变异株的复
制缺陷。
来自临床研究的证据也支持这一
观点,即某些YMDD变异株可能具有
较强的复制能力。例如, Thibault等报
道,在临床上已发现YMDD 变异株引
起的急性HBV 感染。Lok等对YM2
DD变异株的消长状态进行了监测,结
果发现,在停用拉米夫定之后,病人体
内的YMDD变异株可存在数月之久。
因此, YMDD变异株借助YMDD 基序
之外变异,补偿HBV 的复制缺陷,可
以解释临床上有些病人出现变异后
HBV DNA水平并未明显降低,甚至高
于治疗前水平。这也可能是某些YM2
DD变异者病情加重的原因之一。
以往对YMDD变异株复制的研究
在方法上可能存在不足: (1)在检测变
异时多数仅检测一段序列,拉米夫定
治疗后对整个HBV 序列的影响了解
不多; (2)即使研究了HBV 全基因序
列的变异情况,但得到的HBV全基因
序列多数是通过拼接而成的,并不能
完全代表人体内HBV 序列; ( 3)在研
究YMDD 基序和YMDD 基序之外变
异对病毒复制能力的影响时,主要采
用人工体外诱变的方法,所用的HBV
毒株多数来自同一个人工构建的含1.
2拷贝或以上的HBV全基因质粒,并
不能完全反映在拉米夫定的选择性压
力下人体内自然出现的变异株的生物
学特性。今后有必要直接从患者体内
扩增、克隆HBV全基因,在HBV基因
组水平上研究拉米夫定治疗前和变异
后HBV的复制特性。
3. 1. 3 　粒米夫定耐药相关性变异所
致的S基因变异及意义
　　由于HBV聚合酶基因的读码框
架和S基因完全重叠,尤其是HBV RT
的7个具有催化功能的基序(G、F、A、
B、C、D和E)完全与HBsAg的主要中
和功能域(Neutralisation domain ) 即
“a”决定簇重叠,故HBV聚合酶RT区
变异可同时引起S基因变异,例如约
有20%的拉米夫定耐药株( rtV173L /
rtL180M / rtM204V)的包膜蛋白可同时
发生sE164D / sI195M 变异。最近, 国
外已有研究发现,拉米夫定相关HBV
变异株HBsAg与抗2HBs的结合力明
显降低,尤其是伴“a”决定簇内变异
时, HBsAg与抗2HBs的结合力的降低
更明显,如sE104D / sI195M 变异株的
抗原2抗体IC50与HBsAg经典的免疫
逃避株sG145R ( rtW153Q ) 相似。当
HBsAg与抗2HBs的结合力明显降低
时,可成为免疫逃避变异株,导致乙肝
疫苗接种失败。由于我国每年有大量
乙肝患者服用拉米夫定,是一个急需
阐明的问题。
3. 1. 4　拉米夫定耐药HBV YMDD变
异株对其他核苷类药物的敏感性
临床与实验研究证实,拉米夫定
与LdT、FTC、L2FMAU 存在交叉耐药
性,而与阿德福韦、泰诺福韦、恩替卡
韦无交叉耐药性, YMDD 变异株仍对
这些药物敏感,但敏感性低于野毒株。
在临床上,已开始用阿德福韦、泰诺福
韦、恩替卡韦治疗拉米夫定耐药株所
致的感染。在临床前研究中发现,
alamifovir对拉米夫定耐药株也有很强
的抗病毒活性。
3. 2　HBV对阿德福韦的耐药性
阿德福韦酯( adefovir dip ivoxil)是
开环嘌呤类核苷类似物。2002年美国
FDA批准可分别用于治疗HBeAg阳
性和阴性的乙型肝炎患者。研究报
道, HBeAg阳性和阴性的乙型肝炎患
者予阿德福韦治疗48周后,其血清平
均HBV DNA水平分别下降3. 152和
3. 191个log10 拷贝/ml,而经过52 周
的治疗, 阿德福韦组HBeAg 消失率
(24% )稍低于单用拉米夫定治疗组
(32% ) 。阿德福韦治疗2 年时,
HBeAg消失和HBV DNA 转阴( PCR
法)患者的比例增加。阿德福韦的抗
HBV 作用稍逊于拉米夫定, 并且与
HBV基因型无关。阿德福韦的耐药位
点与拉米夫定的耐药位点无交叉,主
要出现在RT的B和D区,变异类型分
别是A181V和N236T,第2～4年的耐
药率分别为2%、7%和15%。体外试
验发现N236T变异株对拉米夫定、恩
替卡韦、LdT等多数核苷类抗HBV药
物敏感。
3. 3　HBV对恩替卡韦的耐药性
恩替卡韦是一种脱氧鸟嘌呤核苷
类似物,选择性抑制HBV复制。它主
要通过对HBV DNA聚合酶引物的抑
制,阻断第一和第二股HBV DNA 合
成,从而阻断HBV 复制。在鸭模型
中,恩替卡韦能抑制HBVcccDNA。恩
替卡韦还能有效抑制野生株和拉米夫
定耐药HBV。与拉米夫定相比,恩替
卡韦每日0. 5mg, 治疗24 周,
HBV DNA比拉米夫定组多下降1. 128
个log10拷贝/ml。Ⅲ期临床试验正在
进行之中。Chang等报道,对181例拉
米夫定治疗失效的患者,予每日1mg
的恩替卡韦治疗, 疗效明显。在500
例恩替卡韦受试者中,只有2 例对拉
米夫定耐药者又出现对恩替卡韦耐
药,耐药性出现在治疗80～100周后。
恩替卡韦耐药株除了含拉米夫定耐药
变异之外(如L180M、M204V / I变异) ,
还同时出现HBV 逆转录酶多个部位
的变异, 如T184A /G/ I/S、S202G/ I和
M250V变异。这种恩替卡韦耐药株仍
对阿德福韦敏感。
3. 4 　HBV 对依曲西他平( emtricita2
tine, FTC)的耐药性
FTC是含氟的胞嘧啶核苷类似
物,能抑制HBV DNA聚合酶和H IV逆
转录酶。该药已被美国和部分国家批
准上市用于治疗H IV21感染。Ⅱ期临
床试验发现,对初治乙型肝炎患者予
依曲西他平( 200mg/d)治疗48 周,能
降低血清HBV DNA 3 个log10 拷贝/
m1,并能显著改善肝组织学。然而,由
于该药的结构与拉米夫定相似,所以
可以出现相同位点的变异和相同的耐
药率。200mg/d治疗48 周, YMDD 变
异率为9% ～16% ,治疗96周为19%
～37%。
3. 5　HBV对LdT的耐药性
L2脱氧胸腺嘧啶( telbivudine,
LdT)核苷和缬氨酰2L2脱氧胞嘧啶核
苷( val - torcitabine, val2LdC)是非常有
发展前景的选择性抑制HBV 复制的
药物。
Lai等报道了LdT的Ⅱb期临床试
验, 104例患者分为三组每日给药, 拉
米夫定组, 400mg或600mg的LdT组
和两药联合治疗组共治疗52 周, LdT
组血清HBV DNA 下降6 个log10 拷
贝/ml。LdT组HBeAg消失率为33% ,
拉米夫定组为28% , 两药联合组为
17%。HBV DNA转阴率( PCR法) LdT
组为64% ,拉米夫定组为32% ,两药
联合组为49%。已报道有4%的患者
在治疗1 年以上出现了LdT的耐药。
LdT与拉米夫定有交叉耐药性。val -
LdC目前正在进行Ⅱ期临床试验。
3. 6　HBV对克拉夫定的耐药性
克拉夫定是嘧啶核苷类似物,体
内外试验发现能抑制HBV 复制。在
美洲旱獭模型进行的试验和人体进行
的I/Ⅱ期临床试验发现,克拉夫定治
疗4周后ALT复常,且在停药后随访
发现能持续抑制病毒复制。最近克拉
夫定(30mg、50mg或安慰剂对照)安全
性及有效性的双盲、随机的Ⅱ期临床
试验研究发现, 88例HBeAg阳性患者
在治疗12周时, 30mg和50mg克拉夫
定剂量组的HBV DNA水平分别下降
4. 147 log10拷贝/ml和4. 145个log10
拷贝/ml, 治疗结束后随访12 周,
HBV DNA的水平仍持续下降3. 132个
log10拷贝/ml和2. 199个log10拷贝/
ml,随访24周时分别下降了2. 128个
log10拷贝/ml和1. 14 个log10 拷贝/
ml。此HBV DNA 下降的程度对拉米
夫定和阿德福韦来说需要52和48周
的疗程才能得到。停药后持续的病毒
抑制可能得益于磷酸化合物的半衰期
较长及代谢活跃。在体外实验中,克
拉夫定与拉米夫定有交叉耐药性,目
前尚无耐药发生率的临床数据。
3. 7　HBV对alamifovir的耐药性
alamifovir是一个由日本首先开发
的新的核苷酸类似物,已进入Ⅱ期临
床试验。它的结构与阿德福韦相似,
是一个含氟的磷酸甲氧基乙酯嘌呤核
苷类似物。给予alamifovir每日5 ～
20mg,治疗28d, HBV DNA 平均下降
1. 5～2. 6个log10拷贝/ml。它对拉米
夫定引起HBV变异株也有抑制作用,
但与阿德福韦有交叉耐药性, 对
N236T变异株所致感染无效。
总之,在用核苷类药物治疗慢性
乙型肝炎的过程中,耐药相关性变异
是难免的, 但耐药发生率不尽相同。
影响发生率的因素目前尚未完全清
楚,有待于进一步研究。
收稿日期: 2005 - 04 - 28
(责任编辑:翁可为)